彼得的好友哈里·奥斯伯恩(詹姆斯·弗朗哥)在同样经历了一系列变故之后，终于察觉到蜘蛛侠的身份原来是自己多年的好友。百感交集的哈里始终抵不过失去父亲巨大痛苦的纠缠，发誓有一天要报杀父之仇。而偶然间，在父亲密室里发现“绿怪”的战斗装备，新一代“加强版绿怪”就此诞生……

坏家伙弗林特·马克(托马斯·海登·邱奇)侥幸从监狱中逃脱，并在偶然的事故之后，变成了威力巨大的“沙人怪”。而当彼得得知此人与杀死叔父本·帕克(克里夫·罗伯岑)的凶手有着莫大的联系时，更燃起了他复仇的怒火——发誓要尽快抓捕“沙人”归案。而强悍的“沙人”自然也不会轻易束手就擒……

再次与恶人们大打出手的蜘蛛侠如今又面临危机——一个神秘外星生物降临地球，偏巧附着在大侠战衣上。原本红蓝相间的帅气“蜘蛛”，瞬间化作邪恶上身的黑色蜘蛛。“黑暗”瞬息间开始对彼得的思想进行着无情的攻击与考验……

正当彼得·帕克对玛丽·简的爱愈发深刻，且两人的爱情即将有所成果时，又一个可爱的女孩格温·斯塔茜(布莱斯·达拉丝·霍华德)的“及时”出现使原本顺利发展的爱情，再次陷入麻烦之中……

此时，饱受爱恨折磨的彼得·帕克再也无法忍受“黑色蜘蛛皮”的纠缠，便一怒之下将其丢弃。恰巧，帕克的同行，正经受着失业与失去妻子双重打击的埃迪·布鲁克(托佛尔·格雷斯)“有幸”得到了黑色蜘蛛服。就此，蜘蛛侠的又一大劲敌——“毒液”亦轰然诞生……